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Danos no DNA
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MODELOS
PRINCÍPIO DO PROTOCOLO (modelo SkinEthicTM RHE)
O objetivo deste estudo é determinar o efeito protetor do produto em teste (formulação), após aplicação tópica no modelo SkinEthicTM RHE e irradiação UVB.
Quatro tecidos epidérmicos humanos reconstruídos in vitro são doseados após aplicação tópica com o agente de teste. Duplicata do tecido é irradiada com UVB a 300 mJ/cm2 e a outra duplicata de controle não irradiada é armazenada no escuro. Imediatamente após a irradiação, as culturas são avaliadas quanto à histologia (coloração H&E) e detecção do dímero de pirimidina.
PROCEDIMENTO DE ENSAIO DETALHADO
2 µl do produto de teste e do controle positivo (Minesol (Roc) SPF 60) são aplicados na superfície do estrato córneo de quatro tecidos SkinEthicTM RHE (tamanho 0,5 cm²). O controle negativo não tratado é executado em paralelo. Os tecidos duplicados são irradiados com UVB 300 mJ/cm² (Solar Simulator BIOSUN). Os tecidos duplicados não irradiados são armazenados no escuro à temperatura ambiente. As culturas são fixadas em formalina imediatamente após a irradiação.
Histologia (coloração H & E) e detecção do dímero de pirimidina são realizadas.
HISTOLOGIA
Para cada produto testado, os tecidos em triplicata serão fixados em solução equilibrada de formalina a 10% e embebidos em parafina. Cortes verticais de quatro mícrons serão corados com hematoxilina/ eosina e fotografados ao microscópio.
A imuno-histoquímica é também realizada para detectar dímeros de pirimidina (anticorpo H3).
REFERÊNCIAS
Assessment of P53, P21 protein expression and cyclobutane pyrimidine dimer formation in a human skin culture model following UVB exposure. Robert C., Doucet O., Bonnet M., Bertino B., Zastrow L. ATLA special issue, p. 304, 1999.